Особенности морфологии актиномицетов, спирохет и др.

01Таксономическое положение и общая характеристика нетипичных прокариот

В медицинской микробиологии традиционное деление бактерий на кокки и палочки не охватывает ряд важных групп патогенов, обладающих выраженным морфологическим своеобразием. К таким микроорганизмам относятся актиномицеты, спирохеты, микоплазмы, риккетсии и хламидии.

Исторически некоторые из этих групп сближали с грибами (актиномицеты из-за ветвления) или вирусами (хламидии и риккетсии из-за мелких размеров и облигатного внутриклеточного паразитизма). Однако современная систематика однозначно относит их к царству Bacteria (Eubacteria) на основании ключевых признаков прокариотической организации:

• Отсутствие истинного ядра, отграниченного кариолеммой; генетический аппарат представлен нуклеоидом (замкнутой кольцевой двухцепочечной ДНК);

• Наличие прокариотических рибосом седиментационного типа 70S (состоящих из субъединиц 50S и 30S), что определяет их избирательную чувствительность к антибиотикам (аминогликозидам, тетрациклинам, макролидам);

• Отсутствие мембранных органелл эукариотического типа (эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, митохондрий, лизосом);

• Размножение бинарным делением (или фрагментацией мицелия у актиномицетов), а не митозом или мейозом;

• Наличие пептидогликана в клеточной стенке у большинства представителей (за исключением класса Mollicutes, лишенного клеточной стенки вовсе).

02Морфология и ультраструктура актиномицетов

Актиномицеты (порядок Actinomycetales, тип Actinomycetota) — грамположительные полиморфные бактерии, способные в процессе роста образовывать ветвящиеся нити — гифы, формирующие переплетающуюся сеть — мицелий.

Строение мицелия

Толщина гиф актиномицетов составляет 0,5–1,5 мкм, что соответствует диаметру обычных бактериальных клеток и в 5–10 раз меньше толщины гиф эукариотических грибов. Гифы ветвятся моноподиально или дихотомически. В культуре различают два типа мицелия:

1. Субстратный мицелий — формируется в толще питательной среды, обеспечивает прикрепление и поглощение питательных веществ;

2. Воздушный мицелий — растет над поверхностью субстрата, обеспечивает образование репродуктивных структур (спор).

В отличие от грибов, гифы актиномицетов длительное время не имеют перегородок (септ) и представляют собой единую синцитиальную структуру с распределенными нуклеоидами, хотя у ряда родов (например, Nocardia) в зрелых культурах появляются септы с последующей фрагментацией нитей на кокковидные и палочковидные элементы.

Репродуктивные структуры

Размножение актиномицетов происходит:

• Вегетативно — фрагментацией мицелия на палочковидные и шаровидные фрагменты;

• С помощью репродуктивных спор (конидий, спорангиоспор), формирующихся на концах воздушных гиф (спороносцев). В отличие от эндоспор бацилл и клостридий, споры актиномицетов служат преимущественно для размножения и расселения, обладают умеренной термостойкостью, но не выдерживают автоклавирования.

Особенности клеточной стенки и окраска

Клеточная стенка актиномицетов устроена по грамположительному типу, содержит толстый слой пептидогликана. У патогенных родов (например, Mycobacterium, традиционно относимых к актиномицетам в широком смысле, и Nocardia) стенка богата миколовыми кислотами и липидами, что придает им свойство кислотоустойчивости (окрашиваются по Цилю — Нельсену в красный цвет). Род Actinomyces (в узком смысле, например, A. israelii) миколовых кислот не содержит и не является кислотоустойчивым; окрашивается по Граму положительно.

03Друзы актиномицетов в патологическом материале

При развитии патологического процесса (актиномикоза) в организме человека актиномицеты формируют характерные тканевые колонии — друзы (гранулы, видимые макроскопически как желтовато-серые зерна в гное диаметром 1–2 мм).

Микроскопическое строение друзы

При микроскопии нативного или окрашенного препарата друза имеет зонтиковидное или радиально-лучистое строение:

• Центральная зона состоит из плотного клубка переплетенных нитей мицелия актиномицета, фрагментов бактериальных клеток и детрита;

• Периферическая зона представлена радиально отходящими расширенными колбовидными структурами («лучами»).

Механизм формирования колбовидных лучей

Периферические «колбы» не являются самостоятельными органами размножения микроба. Это результат защитной реакции: концы гиф покрываются мукополисахаридно-белковым комплексом, образующимся из преципитированных белков плазмы хозяина, иммуноглобулинов, солей кальция и продуктов секреции самого микроорганизма. Этот слой экранирует бактерию от прямого фагоцитоза нейтрофилами и макрофагами.

Диагностическая окраска друз

В гистологических срезах или мазках гноя друзы окрашивают по Граму: центр друзы окрашивается грамположительно (фиолетовый клубок нитей), а периферические колбы — грамотрицательно (розовые лучи) за счет преобладания тканевых белков макроорганизма.

04Морфология и архитектура клетки спирохет

Спирохеты (порядок Spirochaetales) представляют собой одноклеточные грамотрицательные бактерии, имеющие форму тонких, спирально извитых (винтообразных) нитей. Размеры их варьируют от 5 до 500 мкм в длину при толщине всего 0,1–0,6 мкм.

Трехкомпонентный план строения

Ультраструктура спирохет уникальна среди бактерий и включает три анатомических элемента:

1. Протоплазматический цилиндр — тело бактерии, ограниченное цитоплазматической мембраной и пептидогликановым слоем. Цилиндр содержит цитоплазму, рибосомы и нуклеоид;

2. Периплазматические осевые нити (эндожгутики, аксиальные фибриллы) — внутренний двигательный аппарат. Фибриллы отходят от субтерминальных базальных телец на обоих полюсах цилиндра, располагаются внутри периплазматического пространства (между пептидогликаном и наружной мембраной) и направляются навстречу друг другу, перекрываясь в средней части клетки;

3. Наружная оболочка (внешняя мембрана) — гибкий чехол липопротеидной природы, окружающий протоплазматический цилиндр и эндожгутики. Содержит поверхностные белки (липопротеины), но у патогенных спирохет (например, Treponema pallidum) плотность поверхностных интегральных белков чрезвычайно низка, что обеспечивает «антигенную маскировку» от иммунной системы.

Механизм движения спирохет

Вращение периплазматических жгутиков внутри замкнутого пространства между цилиндром и наружной мембраной вызывает крутильные и изгибные деформации жесткого эластичного пептидогликанового остова. Это обусловливает характерные типы движения спирохет:

• Вращательное (вокруг продольной оси);

• Сгибательное (ундулирующее, маятникообразное);

• Поступательное (винтообразное буравящее);

• Контрактильное (сжатие и расправление завитков). Такой механизм движения позволяет спирохетам активно перемещаться в высоковязких средах (слизистые оболочки, соединительная ткань, межклеточный матрикс), где обычные жгутиковые бактерии теряют подвижность.

05Дифференциальная морфология Treponema, Borrelia и Leptospira

Патогенные для человека спирохеты делятся на три основных медицинских рода, четко различающихся по геометрии завитков, строению концевых отделов и тинкториальным свойствам.

Особенности каждого рода

• Трепонемы: из-за малой толщины и слабой оптической плотности не видны при стандартной световой микроскопии без специального контрастирования. В нативном материале (соскоб со дна твердого шанкра) подвижность изучают методом темнопольной микроскопии (блестящие серебристые нити на темном поле).

• Боррелии: благодаря большей толщине и хорошей адсорбции азур-эозина легко обнаруживаются в мазках периферической крови, окрашенных по Романовскому — Гимзе, при рутинной иммерсионной микроскопии.

• Лептоспиры: имеют очень плотные первичные завитки, которые в световом микроскопе сливаются, создавая впечатление гладкой нити с утолщениями на концах. Характерные вторичные завитки на концах придают клетке вид веретена с крючками на обоих полюсах.

06Морфология микоплазм (класс Mollicutes)

Микоплазмы (роды Mycoplasma, Ureaplasma) — мельчайшие свободноживущие прокариоты (диаметр 0,2–0,8 мкм), уникальной особенностью которых является полное генетически обусловленное отсутствие клеточной стенки и путей синтеза пептидогликана.

Строение мембраны и феномен осмотической лабильности

Единственной внешней границей клетки служит трехслойная цитоплазматическая мембрана (ЦПМ). Чтобы компенсировать отсутствие жесткого пептидогликанового экзоскелета, микоплазмы встраивают в липидный бислой мембраны экзогенные стеролы (холестерин), поглощаемые из тканей организма хозяина или культуральной среды. Стеролы придают мембране механическую прочность и относительную устойчивость к осмотическому лизису, сохраняя при этом ее пластичность.

Плеоморфизм

Из-за отсутствия жесткой клеточной стенки микоплазмы обладают выраженным морфологическим полиморфизмом (плеоморфизмом). В одной культуре могут одновременно присутствовать:

• Шаровидные, эллипсоидные и коккобациллярные клетки;

• Кольцевидные структуры;

• Ветвящиеся нити длиной до 10–15 мкм (что изначально обусловило ошибочное название «мико-плазма» — грибоподобная масса).

Специализированные терминальные структуры

У ряда видов (Mycoplasma pneumoniae) на одном из полюсов клетки формируется специализированный терминальный отросток — типичный органоид прикрепления (tip structure). Он содержит адгезивный белок P1, с помощью которого бактерия связывается с сиаловыми кислотами рецепторов реснитчатого эпителия дыхательных путей, предотвращая ее выведение мукоцилиарным клиренсом.

Клинико-диагностическое значение морфологии микоплазм

• Абсолютная природная резистентность к антибиотикам, мишенью которых является синтез клеточной стенки (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, гликопептиды);

• Способность проходить через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм (фильтрующиеся формы);

• Характерный рост на плотных средах с образованием мелких колоний в виде «яичницы-глазуньи» (врастающий плотный центр и светлая полупрозрачная периферия).

07Морфология риккетсий

Риккетсии (порядок Rickettsiales, род Rickettsia) — мелкие полиморфные грамотрицательные бактерии, являющиеся облигатными внутриклеточными паразитами эндотелиоцитов сосудов и клеток ретикулоэндотелиальной системы.

Морфологические формы риккетсий по П.Ф. Здродовскому

В популяции риккетсий наблюдается полиморфизм с закономерной сменой четырех основных форм:

1. Кокковидные (α-формы) — мелкие сферические тельца диаметром около 0,3–0,5 мкм, наиболее устойчивые в окружающей среде;

2. Короткие палочковидные (β-формы) — овоидные палочки длиной 1–1,5 мкм с биполярной конденсацией хроматина;

3. Длинные палочковидные (γ-формы) — палочки длиной 3–4 мкм, прямые или изогнутые;

4. Нитевидные формы (δ-формы) — цепочки и нити длиной от 10 до 40 мкм, представляющие собой сегментирующиеся структуры при активном делении.

Ультраструктура оболочки

Оболочка риккетсий построена по классическому грамотрицательному типу:

• Внутренняя цитоплазматическая мембрана;

• Периплазматическое пространство с тонким слоем пептидогликана;

• Внешняя мембрана, содержащая липополисахарид (ЛПС) и поверхностные белки OmpA и OmpB;

• Снаружи клетку окружает аморфный слизистый микрокапсулярный слой, защищающий микроорганизм при межклеточном распространении.

Локализация в клетке-хозяине

Важный дифференциальный признак: возбудители сыпного тифа (Rickettsia prowazekii) размножаются исключительно в цитоплазме клетки-хозяина, тогда как возбудители клещевых пятнистых лихорадок (Rickettsia rickettsii) способны проникать и размножаться как в цитоплазме, так и внутри ядра.

Методы окраски

По Граму риккетсии красятся слабо (грамотрицательны). Основным методом световой микроскопии является окраска по Здродовскому: риккетсии окрашиваются карболовым фуксином в ярко-красный или рубиновый цвет, а цитоплазма и ядра клеток хозяина докрашиваются метиленовым синим в сине-голубой цвет.

08Морфология и двухфазный жизненный цикл хламидий

Хламидии (порядок Chlamydiales, род Chlamydia) — облигатные внутриклеточные бактерии, поражающие преимущественно эпителиальные клетки слизистых оболочек. Их морфология неразрывно связана с уникальным двухфазным циклом развития, в котором чередуются две морфологические формы.

Морфологические формы

1. Элементарное тельце (ЭТ):

   • Диаметр 0,2–0,3 мкм;

   • Высококонденсированный нуклеоид;

   • Метаболически неактивно, не делится;

   • Инфекционная форма (обеспечивает выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток);

   • Жесткая оболочка стабилизирована развитой сетью белков с дисульфидными связями (COMC — complex of outer membrane proteins);

2. Ретикулярное тельце (РТ):

   • Диаметр 0,8–1,5 мкм;

   • Рыхлый деконденсированный нуклеоид, богатый рибосомами;

   • Метаболически высокоактивно, делится бинарным делением;

   • Неинфекционная форма (вегетативная форма, обеспечивающая репликацию внутри клетки-хозяина).

Особенности оболочки («хламидийный парадокс»)

Долгое время считалось, что хламидии полностью лишены пептидогликана, хотя обладают генами для его синтеза и чувствительны к бета-лактамным антибиотикам. В настоящее время доказано, что тонкий слой пептидогликана синтезируется локально и кратковременно — только в зоне деления ретикулярного тельца (септальный пептидогликан). Жесткость формы элементарного тельца обеспечивается не пептидогликановым каркасом, а ковалентно сшитыми дисульфидными связями цистеин-богатыми белками наружной мембраны (MOMP, OmcB).

Этапы цикла развития

1. Адсорбция ЭТ на мембране эукариотической клетки и эндоцитоз;

2. Формирование внутриклеточного мембранного пузырька — хламидийного включения (вакуоли). Хламидии блокируют слияние включения с лизосомами;

3. Реорганизация: через 6–8 часов компактное ЭТ превращается в крупное метаболически активное РТ;

4. Размножение РТ путем бинарного деления внутри вакуоли;

5. Конденсация: через 24–48 часов РТ претерпевают обратную реорганизацию в компактные инфекционные ЭТ;

6. Лизис клетки-хозяина или экзоцитоз с выходом сотен новых ЭТ в окружающую среду (полный цикл занимает 48–72 часа).

При микроскопии соскобов эпителия включения хламидий выявляют окраской по Романовскому — Гимзе (пурпурно-фиолетовые перинуклеарные включения в голубой цитоплазме) или методом иммунофлуоресценции (РИФ).

09На экзамене

10Частая ошибка