Строение и функции белков. Методы качественного и количественного анализа белков

01Белки и логика темы

Белки — высокомолекулярные биополимеры, построенные из α-аминокислот. Остатки соединены пептидными связями в цепи, а цепи уложены в пространственную структуру. Именно эта структура, а не просто факт «это белок», определяет, что молекула умеет: ускорять реакцию, переносить лиганд, держать ткань, связывать антиген или передавать сигнал.

Короткий пептид и белок не разделены одной обязательной цифрой остатков. Олигопептидом называют короткую цепь, полипептидом — более длинную. Белком обычно считают полипептид, который имеет биологическую функцию и, как правило, устойчивую пространственную структуру. Инсулин одновременно маленький белок и пептидный гормон: жёсткая отсечка здесь только мешает. Для экзамена важно другое. У свободной аминокислоты есть и α-карбоксил, и α-аминогруппа. В цепи эти группы внутренних остатков израсходованы на пептидные связи. Свободными остаются N-конец, C-конец и те радикалы, которые сами способны ионизироваться.

Тема соединяет строение и анализ, потому что это разные вопросы к одной молекуле. Строение отвечает, как цепь собрана и почему из этого следует функция. Качественный анализ отвечает, есть ли пептидные связи или определённый радикал. Количественный анализ отвечает, сколько вещества удалось измерить выбранным сигналом. Сигнал не всегда равен «белку вообще». Один метод считает пептидные связи, другой — ароматические остатки, третий — весь азот, четвёртый — только тот белок, к которому есть антитело.

Рядом лежат темы, которые в этот ответ не переносят целиком. Физико-химические свойства, высаливание, диализ, хроматография и электрофорез — способы выделить и очистить белок. Классы простых белков и строение сложных белков разбирают отдельно. Кинетика ферментов и обмен аминокислот тоже отдельные билеты. Здесь достаточно понять, какая структура делает катализ возможным и какая химическая группа даёт цветную реакцию.

Устный ответ удобно вести в одном направлении: мономер → пептидная связь → четыре уровня структуры → почему форма даёт функцию → чем доказывают присутствие белка и чем измеряют его количество. Если перескочить сразу к списку реакций, неясно, почему биуретовая проба видит денатурированный белок, а функция при денатурации уже потеряна.

02Аминокислоты — мономеры белков

Общий план молекулы

Стандартная аминокислота белка имеет α-углерод, к которому присоединены карбоксильная группа, аминогруппа, водород и боковой радикал R. В состав белков человека при обычной трансляции входят 20 таких аминокислот. Они отличаются не остовом, а радикалом. Остов потом образует повторяющуюся пептидную цепь, радикал остаётся торчать в сторону и решает, будет участок гидрофобным, заряженным, гибким или способным к катализу.

Все эти аминокислоты, кроме глицина, хиральны: α-углерод связан с четырьмя разными заместителями. В белках, собранных на рибосоме, стоит L-ряд относительно глицеринового альдегида. Это не значит, что D-аминокислот в природе нет. Они встречаются в клеточной стенке бактерий и в некоторых пептидных антибиотиках, но не составляют цепи обычных белков человека. Глицин не имеет асимметрического атома: его радикал — водород. Изолейцин и треонин имеют два асимметрических центра, поэтому у них возможны не только L- и D-формы, но и диастереомеры. Для экзамена достаточно не перепутать ряд: белковый остаток — L, а не «любой оптический изомер».

Пролин устроен иначе. Его азот входит в пирролидиновое кольцо, поэтому это иминокислота: азот вторичный. Кольцо ограничивает подвижность остова и не отдаёт тот водород, который обычная пептидная группа отдаёт в водородную связь. Отсюда два следствия, которые спрашивают отдельно: пролин ломает регулярную α-спираль, а с нингидрином даёт не сине-фиолетовый, а жёлтый или жёлто-оранжевый продукт.

Селеноцистеин встраивается котрансляционно в отдельные селенопротеины по особому сигналу. Это не двадцать первая обычная аминокислота каждого человеческого белка. Пирролизин встречается у части архей и бактерий и к белкам человека не относится.

Заряд и цвиттер-ион

Карбоксильная группа — заметно более сильная кислота, чем группа алкиламмония. При физиологическом pH карбоксил свободной аминокислоты депротонирован и несёт минус, а аминогруппа протонирована и несёт плюс. Такую форму называют цвиттер-ионом. Суммарный заряд «нейтральной» аминокислоты при этом близок к нулю, но молекула не незаряжена: на ней есть оба заряда.

Изоэлектрическая точка — pH, при котором суммарный заряд частицы равен нулю. Для аминокислоты без ионизируемого радикала она лежит между константами кислотности двух α-групп. Кислый радикал сдвигает её в кислую сторону, основный — в щелочную. Подробная связь изоэлектрической точки с растворимостью и электрофорезом относится к физико-химическим свойствам. Здесь заряд нужен, чтобы понять структуру.

В полипептиде картина другая. Пептидная связь в обычном диапазоне pH не несёт полного заряда. Внутренний остаток уже отдал свой α-карбоксил и свою α-аминогруппу в остов. Заряд цепи складывается из N-концевой аминогруппы, C-концевого карбоксила и ионизируемых радикалов. Поэтому белок — не «сумма зарядов двадцати свободных аминокислот». Лизин внутри цепи заряжен по ε-аминогруппе, а не потому, что у него сохранилась свободная α-аминогруппа.

Гистидин стоит особняком среди основных аминокислот. Лизин и аргинин при физиологическом pH заряжены практически полностью. Боковая группа гистидина заметно протонируется уже вблизи нейтрального pH, поэтому часть остатков гистидина заряжена, а часть нет. Это делает гистидин удобным для кислотно-основного катализа и для буферной ёмкости белка около физиологического pH. Точные константы кислотности зависят от окружения в глобуле и как универсальные числа не заучиваются.

Классификация по радикалу

Для структуры полезнее всего делить аминокислоты по полярности и заряду радикала при физиологическом pH. Химические семейства — алифатические, ароматические, серосодержащие, гидроксилсодержащие — нужны, когда речь идёт о цветной реакции или о конкретной связи.

Границы не абсолютно жёсткие. Триптофан часто ставят среди неполярных ароматических, хотя индол слабо полярен. Тирозин имеет фенольный гидроксил и одновременно гидрофобное кольцо, поэтому встречается и на поверхности, и на границе ядра. Цистеин при физиологическом pH обычно не заряжен, но его тиольная группа способна терять протон в более щелочной среде и окисляться до дисульфида. Глицин неполярен, но настолько мал, что часто сидит в тесных поворотах, а не в гидрофобном ядре.

Отдельные радикалы стоит помнить по роли, а не списком формул.

• Цистеин даёт дисульфидную связь. Два остатка, соединённые такой связью, называют цистином.

• Серин, треонин и тирозин могут фосфорилироваться. Появление отрицательного заряда меняет локальную конформацию и узнавание другими белками.

• Аспарагин и глутамин — амиды кислых аминокислот. Сами они незаряжены и образуют водородные связи. При жёстком кислотном гидролизе амиды превращаются в аспартат и глутамат, поэтому анализ состава их уже не различает.

• Метионин гидрофобен, сера в нём спрятана в тиоэфир. Поэтому он не ведёт себя в реакции Фоля как цистеин.

• Фенилаланин, тирозин и триптофан поглощают ультрафиолет и дают ксантопротеиновую реакцию. Фенилаланин нитруется труднее: его кольцо не активировано гидроксилом или индолом.

Незаменимые аминокислоты и модификации

Незаменимая аминокислота — та, которую человек не синтезирует в количестве, достаточном для потребности, и должен получать с пищей. К ним относят валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин и триптофан. Консультация ВОЗ/ФАО/УООН 2007 года рассматривает гистидин как незаменимый и для взрослых. В более старых учебниках его иногда оставляли незаменимым главным образом для детей. Аргинин условно незаменим: взрослому организму его синтеза обычно хватает, при росте и части стрессовых состояний — нет.

Тирозин заменим только пока есть фенилаланин, из которого он образуется. Цистеин зависит от поступления серы метионина. Это не повод заносить их в основной список незаменимых, но это объясняет, почему качество пищевого белка нельзя свести к одному грамму азота.

После сборки цепи часть остатков химически изменяется. В коллагене пролин и лизин гидроксилируются. Эти гидроксиаминокислоты не имеют собственных кодонов: они не вставляются рибосомой как отдельные мономеры. Фосфорилирование, гликозилирование и образование дисульфида тоже не записаны отдельной буквой генетического кода. Поэтому последовательность, прочитанная по ДНК, показывает порядок стандартных остатков, но не все ковалентные добавки зрелого белка.

Пищевая классификация не заменяет структурную. Незаменимая аминокислота может быть гидрофобной, заряженной или ароматической. На экзамене нужно назвать принцип деления, а не смешивать два списка в один.

03Пептидная связь и полипептидная цепь

Пептидная связь образуется между α-карбоксилом одной аминокислоты и α-аминогруппой другой. Формально это конденсация: уходит вода, остаётся амидная группа −CO−NH−. В водном растворе самопроизвольно и с хорошим выходом такая связь не копится. В клетке аминокислота сначала активируется в виде аминоацил-тРНК, а пептидную связь создаёт рибосома. Для этого билета не нужен весь путь трансляции. Нужен химический результат: связь амидная, направленная и дорогая по энергии, поэтому цепь не распадается сама при обычных условиях.

У связи есть частичный двоесвязный характер. Неподелённая пара азота сопряжена с карбонилом, электронная плотность размазана между C, O и N. Связь C−N короче обычной одинарной и длиннее двойной. Вращение вокруг неё затруднено. Шесть атомов пептидной группы лежат примерно в одной плоскости: α-углерод первого остатка, углерод карбонила, кислород, азот, водород амида и α-углерод следующего остатка. Это жёсткое звено цепи, а не шарнир.

Соседние α-углероды почти всегда стоят в транс-положении: так объёмные радикалы меньше мешают друг другу. Цис-пептидная связь встречается реже и чаще бывает перед пролином, где кольцо меняет стерический баланс. Формулировка «все пептидные связи только транс» слишком абсолютна. Верно: транс преобладает, цис — исключение, а не равноправный вариант.

Свободное вращение остаётся вокруг одинарных связей при α-углероде. Угол φ — вращение вокруг N−Cα, угол ψ — вокруг Cα−C. Не всякая пара углов допустима: радикалы и остов сталкиваются. Карта Рамачандрана показывает разрешённые области. α-Спираль и β-тяж занимают разные области этой карты. Поэтому цепь не складывается «как угодно». Жёсткие пептидные плоскости соединены шарнирами с ограниченным ходом, и регулярная вторичная структура — это повторение удачной пары углов.

Цепь имеет направление. На N-конце осталась свободная α-аминогруппа, на C-конце — свободный α-карбоксил. Последовательность пишут от N-конца к C-концу. В названии пептида все остатки, кроме C-концевого, получают суффикс «-ил»: аланилглицилсерин — это аланин, отдавший карбоксил, затем глицин, затем серин со свободным карбоксилом. Перевернуть запись значит назвать другую молекулу.

Пептидная связь устойчива к умеренным сдвигам pH и не даёт цветных реакций на свободную аминогруппу каждого остатка. Чтобы узнать состав, цепь приходится гидролизовать. Чтобы увидеть саму связь, используют биуретовую реакцию: в крепкой щёлочи пептидные атомы азота координируют медь. Это уже аналитическое следствие геометрии, а не отдельный факт «белок фиолетовеет».

Гидролиз рвёт последовательность необратимо для данного образца. Кислотный гидролиз, которым пользуются для состава, разрушает триптофан и частично повреждает серин и треонин, а аспарагин и глутамин превращает в кислоты. Щелочной гидролиз сохраняет триптофан, но портит другие остатки. Поэтому ни один гидролиз сам по себе не даёт и полную последовательность, и полный неискажённый состав.

04Первичная структура

Первичная структура — это порядок аминокислотных остатков в полипептидной цепи, соединённых пептидными связями. Её задаёт ген. Белки с разной функцией имеют разные последовательности. Одинаковая функция у близких видов обычно сопровождается сходной, но не обязательно тождественной последовательностью. Состав — набор и количество остатков — первичной структурой не является. Два пептида могут содержать одни и те же аминокислоты в разном порядке и быть разными молекулами.

Дисульфидные связи ковалентны, и их положение определено тем, какие цистеины стоят в последовательности. В строгом смысле они входят в ковалентную структуру. В учебном ответе о четырёх уровнях их обычно относят к связям, стабилизирующим третичную структуру или скрепляющим цепи, потому что они не строят остов, а запирают уже выбранную укладку. Обе формулировки совместимы, если не говорить, будто дисульфид — это и есть пептидная связь. Пептидная связь создаёт последовательность. Дисульфид соединяет два радикала цистеина.

Почему порядок важнее набора

Одна замена может не задеть длину цепи и почти не изменить состав, но изменить поверхность и функцию. В гемоглобине S глутамат в положении 6 β-цепи заменён на валин. Глутамат заряжен и хорошо переносит соседство с водой. Валин гидрофобен. На поверхности дезоксиформы появляется липкий гидрофобный участок, молекулы гемоглобина S полимеризуются, эритроцит теряет пластичность. Это пример цены первичной структуры, а не лекция о серповидноклеточной болезни. Высшие уровни здесь не «отменились»: изменилась последовательность, поэтому изменилась поверхность уже собранной молекулы.

Последовательность необходима для нативной укладки, но клетка не является разбавленным раствором из опыта Анфинсена. Шапероны, модификации и небелковые группы влияют на то, будет ли достигнут рабочий фолд. Об этом речь ниже, при сворачивании. На экзамене нельзя сводить всё к фразе «первичная структура всегда сама и мгновенно равна функции».

Как устанавливают последовательность

Сначала белок очищают и проверяют, одна ли это цепь. Аминокислотный состав после гидролиза говорит, какие остатки есть и в каком соотношении. Он не говорит, в каком порядке они стоят.

N-конец узнают по свободной α-аминогруппе. Реактив Сенгера, 2,4-динитрофторбензол, метит её; после гидролиза меченый остаток отличается от остальных, но так виден только концевой остаток, а не вся цепь. Дансилхлорид делает то же флуоресцентной меткой. Метод Эдмана использует фенилизотиоцианат и отщепляет N-концевой остаток в виде фенилтиогидантоина, не разрушая оставшуюся цепь. Цикл можно повторять. Если N-конец блокирован, Эдман не стартует.

C-конец снимают карбоксипептидазой или гидразинолизом Акабори. При нагревании с гидразином внутренние остатки становятся гидразидами, а C-концевая аминокислота остаётся свободной, потому что её карбоксил не был в пептидной связи.

Длинную цепь режут на перекрывающиеся фрагменты. Трипсин гидролизует по карбоксильной стороне лизина и аргинина, а не «между аргинином и лизином». Химотрипсин предпочитает карбоксильную сторону фенилаланина, тирозина и триптофана. Бромциан рвёт по карбоксильной стороне метионина. Фрагменты секвенируют, а порядок собирают по перекрываниям второго расщепления. Дисульфиды перед этим обычно восстанавливают и алкилируют, иначе куски останутся сшитыми; сравнение пептидных карт до и после разрыва показывает, какие цистеины были парой.

Секвенирование кодирующей ДНК предсказывает порядок стандартных остатков и сегодня является обычным путём. Оно не показывает гидроксилирование, фосфорилирование, гликозилирование, дисульфиды и то, какие концы остались после вырезания предшественника. Зрелая первичная структура белка и перевод гена — не всегда одна и та же строка.

05Вторичная структура

Вторичная структура — локальная конформация остова, которая держится водородными связями между пептидными группами, а не между радикалами. Радикалы при этом важны косвенно: они разрешают или запрещают повторение углов. Регулярные формы — α-спираль и β-структура. Повороты и петли не менее функциональны, хотя не выглядят как бесконечный повтор.

α-Спираль

α-Спираль в белках из L-аминокислот закручена вправо. На один виток приходится 3,6 остатка. Каждый остаток поднимается вдоль оси на 0,15 нм, шаг спирали — 0,54 нм. Карбонил остатка i образует водородную связь с NH остатка i+4. Связи идут примерно вдоль оси. Радикалы смотрят наружу, поэтому спираль может одной гранью быть гидрофобной, а другой — полярной.

Спираль рвётся там, где повтор углов или водородных связей невозможен. Пролин не имеет водорода при азоте пептидной группы и жёстко изгибает остов; часто он стоит в начале спирали, но не внутри регулярного витка. Глицин слишком гибок: зафиксировать его в спирали энтропийно дорого, зато он удобен в повороте. Рядом стоящие одноимённые заряды отталкиваются. Короткие левые участки возможны там, где много глицина, но для обычных L-остатков устойчива правая спираль. Говорить «любой фрагмент любой цепи обязан быть спиралью» нельзя.

Остов спирали насыщает свои водородные связи внутри себя. Поэтому α-спираль из гидрофобных радикалов хорошо пересекает мембрану: полярные группы остова не торчат в липид. Это структурная причина, почему трансмембранные участки часто спиральны, а не отдельная «мембранная функция аминокислот».

β-Структура

β-Тяж — вытянутый участок остова. Соседние радикалы торчат по разные стороны листа, вверх и вниз. Водородные связи лежат между тяжами, примерно в плоскости листа, а не вдоль одного витка. Тяж сам по себе ещё не лист. Лист возникает, когда тяжи сшиты этими связями.

В антипараллельном листе соседние тяжи идут в противоположных направлениях, N-конец одного рядом с C-концом другого. Водородные связи при этом ближе к линейным, и такая геометрия обычно устойчивее. Два тяжа одной цепи легко образуют шпильку. В параллельном листе все тяжи смотрят в одну сторону, связи менее линейны, а цепи, чтобы вернуться, нужен длинный соединительный ход. Часто этот ход содержит спираль: получается мотив βαβ.

β-Слой не растягивается так, как пружина. Шёлковый фиброин использует именно это: вытянутые листы дают прочность на разрыв. Это не значит, что всякий фибриллярный белок построен из β-листов.

Повороты, петли и коллагеновая спираль

β-Поворот меняет направление цепи на коротком участке, часто из четырёх остатков, с водородной связью между первым и четвёртым. Пролин и глицин здесь часты: один ограничивает угол, другой помещается в тесноте. Петли длиннее и менее регулярны. Называть их «испорченной структурой» неверно. Активный центр и место связывания часто лежат именно в петле, которую держат соседние регулярные элементы.

Коллагеновая спираль — отдельный тип вторичной структуры, не α-спираль и не β-лист. Три левые спирали скручены в правую суперспираль. В последовательности повторяется глицин в каждом третьем положении: только водород глицина помещается в тесный центр тройки. Гидроксипролин, появившийся после трансляции, стабилизирует эту упаковку водородными связями. Поэтому коллаген нельзя описывать параметрами α-спирали 3,6 остатка на виток.

α-Кератин устроен ещё иначе: это суперспираль из α-спиралей, а не β-лист. Фибриллярный значит «вытянутый и обычно плохо растворимый», а не «всегда β». Глобулярный значит «компактный», а не «всегда одна только α-спираль». В глобулах встречаются и спирали, и листы, и почти лишённые регулярных участков цепи.

06Третичная структура, домены и сворачивание

Третичная структура — укладка всей полипептидной цепи в пространстве, со всеми её спиралями, листами и петлями. У глобулярного белка получается компактная глобула. У фибриллярного — вытянутая нить или стержень. Форма — следствие последовательности и среды, а не отдельная химическая связь.

Что собирает глобулу

В воде неполярные радикалы невыгодны на поверхности: вокруг них вода упорядочивается. Когда такие радикалы собираются внутри, часть этой воды освобождается, энтропия растворителя растёт. Это гидрофобный эффект. Он главный термодинамический двигатель сворачивания типичной глобулы. Называть его ковалентной гидрофобной связью неверно. Внутри ядра радикалы дополнительно прилегают друг к другу ван-дер-ваальсовыми контактами.

Остальные взаимодействия задают, какая именно укладка выбрана.

• Водородные связи между полярными радикалами и часть связей остова, не занятых вторичной структурой, уточняют ориентацию.

• Ионные, или солевые, связи возникают между противоположно заряженными радикалами. В воде они слабее, чем кажется по схеме, потому что вода экранирует заряды. Внутри низкополярного ядра отдельная солевая связь может быть существенной, но не она одна держит глобулу.

• Дисульфидная связь ковалентно сшивает два цистеина. Она скорее запирает уже найденную укладку, чем выбирает её с нуля. Для внеклеточных белков это частый замок: снаружи среда окислительная. В цитозоле много восстановленного глутатиона, и постоянные дисульфиды менее характерны. «Внутри клетки дисульфидов не бывает никогда» — слишком сильная формула.

• Ионы металлов могут координировать радикалы цистеина, гистидина и кислых аминокислот и тем самым держать местную петлю.

Полярные и заряженные радикалы преимущественно остаются с водой. Так возникает рабочее разделение: гидрофобное ядро, полярная поверхность. Исключения есть. Заряженная группа внутри глобулы обычно нужна для катализа или связывания и окружена партнёрами, которые её стабилизируют.

Домен — часть цепи, которая способна свернуться относительно самостоятельно и часто несёт отдельную функцию. Крупный белок бывает суммой доменов, соединённых гибким участком. Это всё ещё третичная структура одной цепи, пока домены не принадлежат разным полипептидам.

Супервторичная структура, или мотив, — устойчивое сочетание элементов вторичной структуры. Шпилька β, мотив βαβ, связка «спираль–поворот–спираль» у части ДНК-связывающих белков, суперспираль с лейциновой застёжкой у части факторов транскрипции, а также у кератина и стержней миозина. В застёжке гидрофобные остатки, часто лейцин, повторяются так, что образуют полосу контакта между спиралями. Цинковый палец — короткий мотив, в котором цинк координирован цистеинами и гистидинами и держит небольшую петлю; многие такие пальцы узнают ДНК. Фиксированной длины «ровно двадцать остатков» у этого мотива нет. Мотив не заменяет четыре уровня. Он объясняет, как вторичная структура складывается в третичную.

Сворачивание и денатурация

Случайный перебор всех конформаций длинной цепи занял бы недостижимо много времени. Сворачивание идёт направленно: локальные элементы вторичной структуры и гидрофобный коллапс сужают путь. Опыт Анфинсена с рибонуклеазой показал принцип. Белок, развёрнутый мочевиной и с восстановленными дисульфидами, терял активность. После удаления денатуранта и правильного замыкания дисульфидов активность возвращалась. Значит, информация о нативной укладке этого белка сидела в последовательности. Если дисульфиды замыкались наугад, пока цепь ещё была развёрнута, получалась неактивная «перепутанная» форма. Малый тиоловый реагент позволял связям перетасоваться к нативному набору.

В клетке многим цепям помогают шапероны. Они узнают выставленные гидрофобные участки незаконченной цепи и не дают им склеиться с чужими цепями. Шаперонины дают изолированную полость для досворачивания. Это не отменяет последовательность. Это признание, что цитозоль тесный.

Не у всякого белка есть одна жёсткая третичная структура. Внутренне неупорядоченные белки или их участки остаются гибкими и приобретают форму при связывании партнёра. Так устроены многие регуляторные взаимодействия. Прионный принцип другой: одна и та же последовательность может иметь две укладки, и патологическая укладка способна переводить нормальные молекулы в свою форму. Последовательность необходима, но фраза «одна последовательность всегда означает одну безвредную конформацию» абсолютна неверно.

Денатурация — утрата нативной высшей структуры при сохранении пептидных связей. Исчезает биологическая активность, потому что исчезает точное расположение радикалов. Первичная структура остаётся, поэтому цветные реакции на пептидные связи и радикалы не требуют нативной глобулы. Иногда денатурация обратима, как в опыте Анфинсена. Часто агрегат или перепутанные дисульфиды делают возврат невозможным без помощи. Каталог денатурантов и условия высаливания — предмет физико-химических свойств. Здесь важно различение: функция следит за укладкой, групповая реакция — за ковалентной химией.

07Четвертичная структура

Четвертичная структура — взаимное расположение нескольких полипептидных цепей в одном рабочем белке. Отдельные цепи называют субъединицами или протомерами, всю сборку — олигомером. Если цепи одинаковые, олигомер гомомерный. Если разные — гетеромерный.

Эта структура есть не у всех белков. Миоглобин запасает кислород одной цепью и четвертичной структуры не имеет. Гемоглобин A построен из двух α- и двух β-субъединиц. Связывание кислорода одной субъединицей меняет конформацию контактов и повышает сродство остальных. Так из обычного связывания лиганда получается кооперативность. Миоглобин при том же геме кооперативности не показывает: передавать сдвиг некому. Химия гема относится к сложным белкам. Здесь важен белковый каркас.

Между субъединицами обычно работают те же нековалентные контакты, что и внутри глобулы: гидрофобные поверхности стыка, водородные связи, солевые мостики, ван-дер-ваальсово прилегание. Пептидные связи субъединицы друг с другом не сшивают. Межцепьевой дисульфид встречается, например у антител, но для определения четвертичной структуры не обязателен. Инсулин после вырезания промежуточного участка состоит из двух цепей, скреплённых дисульфидами. Это многоцепочечная ковалентная молекула. Её не стоит ставить как прототип нековалентного олигомера рядом с гемоглобином, хотя оба примера показывают, что «один белок» не всегда равен «одна цепь».

Субъединичное строение даёт несколько выгод, и ни одна не является единственной.

Кооперативность и аллостерическая регуляция возможны, потому что стык передаёт конформацию. Активность можно сдвигать сборкой и разборкой, не синтезируя белок заново. На несколько одинаковых цепей тратится один ген, а ошибка синтеза портит одну субъединицу, которую легче отбраковать, чем всю огромную цепь. Крупная структура эволюционно собирается из уже удачных доменов и протомеров.

Разборка олигомера уничтожает четвертичную структуру, но третичная структура отдельной субъединицы может сохраниться. Это частый экзаменационный переход. Денатурация идёт дальше: теряется и третичная укладка. Гидролиз идёт ещё дальше: рвутся пептидные связи.

Четыре уровня — каркас ответа, предложенный ещё Линдерстрём-Лангом и до сих пор принятый на экзамене. Мотивы, домены и неупорядоченные участки его уточняют, а не отменяют.

08Функции белков и связь со структурой

Функция белка — это следствие формы, динамики и химии радикалов, а не отдельная этикетка. Один и тот же набор из двадцати аминокислот даёт фермент, нить коллагена и антитело, потому что различаются порядок, укладка и партнёры. Ниже функции сгруппированы так, как их ждут в ответе, но каждая привязана к структуре.

Катализ

Ферменты — белки, ускоряющие конкретные реакции. Активный центр — не «особая аминокислота», а пространственное сближение нескольких радикалов. Они ориентируют субстрат, стабилизируют переходное состояние, отдают или принимают протон. Гистидин удобен для последнего, потому что его заряд меняется вблизи нейтрального pH. Серин, цистеин, аспартат и глутамат часто непосредственно участвуют в разрыве связей. Кинетика, классы ферментов и регуляция активностью — отдельный раздел. Здесь достаточно механизма: если денатурация разводит радикалы центра, катализ исчезает, хотя аминокислотный состав на месте.

Опора и движение

Структурные белки держат форму за счёт повторяющейся укладки и поперечных сшивок. Коллаген прочен на растяжение, потому что три цепи плотно скручены, а глицин позволяет им сойтись. Кератин жёсток там, где суперспирали дополнительно сшиты дисульфидами. Эластин растягивается за счёт иной сетки, а не потому что «тоже коллаген». Подробная классификация склеропротеинов относится к простым белкам.

Двигательные белки используют ту же идею иначе. Актин и миозин меняют взаимную укладку при связывании и гидролизе нуклеотида, и скольжение нитей даёт сокращение. Тубулин, кинезин и динеин переводят химический цикл в движение по микротрубочке. Без конформационного цикла был бы каркас, но не мотор.

Транспорт, запас и удержание воды

Гемоглобин переносит кислород именно как олигомер: кооперативность возникает из четвертичной структуры. Альбумин плазмы имеет карманы для разнообразных лигандов и за счёт количества молекул удерживает воду в сосуде. Это не отдельная магическая функция, а следствие растворимой глобулы, которая плохо проходит стенку капилляра. Трансферрин переносит железо, ферритин его запасает внутри белковой оболочки. Мембранный переносчик проводит вещество через бислой, потому что трансмембранные спирали закрывают полярный остов от липида и собирают путь для лиганда.

Казеин молока и овальбумин яйца — запас аминокислот для потомства. Это питательная функция. Она не отменяет, что белок при этом имеет структуру. Использовать мышечный белок как топливо организм может, но это разбор рабочей молекулы, а не специализированный энергетический запас вроде гликогена или триацилглицерола. Ставить энергетическую функцию в один ряд с катализом как равноправное назначение белков не стоит.

Регуляция, защита и узнавание

Пептидные гормоны, рецепторы и факторы транскрипции работают комплементарностью формы. Лиганд садится в карман, рецептор меняет конформацию, сигнал уходит дальше. Фосфорилирование серина, треонина или тирозина добавляет заряд и может открыть или закрыть такой карман. Антитело узнаёт антиген вариабельным доменом; эффекторная часть той же молекулы уже другая по форме и говорит с клетками иммунитета. Фибриноген превращается в фибрин и собирает сетку, потому что после отщепления пептидов открываются поверхности сборки. Это защитная и гемостатическая роль белка, без разбора всего каскада свёртывания.

Буферное действие плазменных белков связано с ионизируемыми радикалами, особенно гистидина. Оно реально, но это следствие заряда, а не отдельный структурный уровень. Подробно амфотерность разбирают среди физико-химических свойств.

Токсины бактерий и ядов тоже белки: их функция вредна для жертвы и полезна для производителя. Структурный принцип тот же — точный центр или пора в мембране. Отдельный список ядов экзамену по этой теме не нужен.

Итог для устного ответа: катализ, опору, движение, транспорт, запас, регуляцию, защиту и узнавание объединяет одно. Последовательность выбирает укладку, укладка расставляет радикалы, радикалы выполняют химическую работу. Потеря высшей структуры бьёт по функции раньше, чем гидролиз уничтожит первичную структуру.

09Качественный анализ белков

Качественная реакция отвечает на вопрос «есть ли искомая группа», а не «сколько миллиграммов» и не «жива ли нативная укладка». Поэтому денатурированный белок продолжает давать биуретовую и групповые реакции: пептидные связи и радикалы на месте. Потеря активности денатурацией эти пробы не отменяет.

Пробы делят по избирательности. Общая белковая проба видит признак, который есть почти у всякой достаточно длинной цепи. Групповая видит один тип радикала и молчит, если этого радикала в молекуле нет. Осадительная проба видит потерю растворимости и не называет аминокислоту. Отрицательный групповой результат не доказывает отсутствие белка. Положительный результат со свободной аминокислотой не доказывает, что в пробирке был белок.

Биуретовая реакция

Биуретовая реакция, или реакция Пиотровского, обнаруживает пептидные связи. В щелочной среде Cu²⁺ координируется атомами азота этих связей. Пептидный водород при этом вытесняется, возникает хелатный комплекс фиолетового цвета. Тартрат в реактиве нужен, чтобы медь не выпала гидроксидом. Самого биурета в реактиве нет. Название историческое: биурет, продукт конденсации двух молекул мочевины, имеет две амидные группы и даёт тот же тип окраски.

Характерный белковый фиолетовый цвет требует участия не менее двух пептидных связей. Свободные аминокислоты реакцию не дают. Дипептид с одной пептидной связью не даёт этой фиолетовой окраски; в части химических описаний ему приписывают иной, синий оттенок комплекса, трипептиду — фиолетовый, более длинным цепям — красно-фиолетовый. Для экзамена безопасная граница такая: положительная белковая биуретовая реакция начинается там, где пептидных связей хотя бы две. Интенсивность связана с числом этих связей, поэтому та же химия годится и для количественного метода. Аммиак и Трис мешают, потому что сами координируют медь.

Нингидриновая реакция

Нингидрин в первую очередь проба на свободную первичную α-аминогруппу. Аминокислота декарбоксилируется, выделяется аммиак, и продукты конденсации дают сине-фиолетовый пурпур Руэмана. Пролин и гидроксипролин — вторичные амины. Они не идут по этому пути и дают жёлтый или жёлто-оранжевый продукт. Белок реагирует слабее и часто лишь при более жёстком нагревании: свободны N-конец и ε-аминогруппы лизина, а не аминогруппа каждого остатка. Поэтому нингидрин нельзя называть главной реакцией на белок. Это главная реакция на свободные аминокислоты. След от пальца на бумаге синеет по той же причине: на бумаге остались аминокислоты и доступные аминогруппы, а не потому что нингидрин «красит белок целиком».

Реакции на отдельные радикалы

Ксантопротеиновая реакция — нитрование ароматического кольца концентрированной азотной кислотой. Нитропроизводные жёлтые. Щёлочь переводит их в соль хиноидного типа, и цвет становится оранжевым. Легко реагируют тирозин и триптофан. Фенилаланин нитруется труднее, потому что бензольное кольцо не активировано. Белок, бедный этими остатками, например коллаген и полученный из него желатин, даёт слабую или отрицательную пробу и при этом положительную биуретовую. Жёлтый цвет доказывает ароматику, а не любой белок.

Реакция Миллона видит фенольный гидроксил тирозина. Реактив содержит соли ртути в азотной кислоте; при нагревании появляется красное окрашивание или красный осадок. Фенилаланин фенола не имеет и реакцию не даёт. Реактив токсичен; на экзамене нужен принцип, а не пропись.

Реакция Адамкевича, в варианте Хопкинса–Коула, обнаруживает индол триптофана. Глиоксиловая кислота в присутствии концентрированной серной кислоты даёт красно-фиолетовое кольцо на границе слоёв. Реакция Эрлиха с п-диметиламинобензальдегидом в кислоте тоже конденсация по индолу и тоже красно-фиолетовая. Нет триптофана — нет окраски, хотя белок может быть.

Реакция Сакагучи обнаруживает гуанидиновую группу аргинина. В щёлочи α-нафтол и гипобромит или гипохлорит дают красное окрашивание. Другие монозамещённые гуанидины способны мешать. Проба не равна доказательству интактного белка.

Реакция Фоля обнаруживает лабильную серу цистеина и цистина. Щелочной гидролиз отщепляет сульфид, ацетат свинца превращает его в тёмный осадок сульфида свинца. Сера метионина сидит в тиоэфире и в условиях этой пробы обычно не отщепляется, поэтому метионин реакцию Фоля не даёт. Нитропруссид натрия в щёлочи окрашивается свободной SH-группой цистеина в красно-фиолетовый цвет. Цистин, где сера уже в дисульфиде, нитропруссид не окрашивает, пока дисульфид не восстановлен. Фоль после щелочного расщепления видит и цистеин, и цистин. Это разные вопросы: «есть ли свободный тиол» и «есть ли лабильная сера».

Диазореакция Паули использует диазотированную сульфаниловую кислоту. Азосочетание идёт по имидазолу гистидина и по фенолу тирозина, цвет красно-оранжевый. Если Миллон молчит, а Паули положительна, из этой пары остатков вероятен гистидин. Если положительны обе, тирозин точно есть, гистидин не исключён.

Осаждение как обнаружение

Проба Геллера и проба с сульфосалициловой кислотой обнаруживают белок иначе. Концентрированная азотная кислота на границе с раствором денатурирует белок и снимает с него заряд, молекулы слипаются, появляется белое кольцо. Сульфосалициловая кислота осаждает белок как кислый реагент. Нагревание в слабокислой среде, где суммарный заряд белка мал и цепи уже развернулись, тоже даёт хлопья. В крепкой щёлочи тот же белок может остаться растворённым: заряд мешает молекулам сблизиться.

Эти пробы не называют радикал и не измеряют точную концентрацию. Они отвечают: в жидкости есть вещество, которое ведёт себя как белок при денатурации. Их используют как поиск белка в моче. Высаливание, диализ и хроматография решают другую задачу — разделить и очистить — и относятся к следующему билету. Осадок после кислоты ещё даст биуретовую реакцию, если пептидные связи целы. Он уже не обязан сохранить ферментативную активность.

10Количественный анализ белков

Количественный метод переводит химический или физический сигнал в количество. По закону Бугера–Ламберта–Бера поглощение окрашенного продукта пропорционально концентрации в рабочем диапазоне. Поэтому строят калибровку по белку известной концентрации, часто по бычьему альбумину, и по ней читают образец. Если метод зависит от состава, альбумин и исследуемый белок дают разный цвет на один миллиграмм. Результат тогда относительный. Это не ошибка студента, а свойство химии пробы.

Нужно заранее решить, что измеряют: общий белок, азот, ароматические остатки или один конкретный белок. Слово «концентрация белка» без этой оговорки двусмысленно.

Методы, которые считают пептидные связи или восстановленную медь

Биуретовый метод — та же координация Cu²⁺ с пептидными связями. Фиолетовую окраску измеряют около 540 нм. На единицу массы у разных белков плотность пептидных связей сопоставима, поэтому метод слабее зависит от того, богат ли белок тирозином или аргинином. Свободные аминокислоты почти не мешают. Чувствительность умеренная: метод удобен там, где белка много, например в сыворотке. Аммиак, аммонийные соли и Трис завышают или искажают результат, связывая медь. Образец при реакции щелочной, нативная структура не сохраняется. Для общего белка сыворотки это обычно не мешает: нужна масса цепей, а не активность.

Метод Лоури добавляет к биуретовому комплексу вторую реакцию. Комплекс меди, а также тирозин и триптофан восстанавливают фосфорномолибденово-вольфрамовый реактив Фолина–Чокальтеу. Возникает синий продукт, который при низких концентрациях читают в длинноволновой видимой области, часто около 750 нм. Сигнал сильнее, чем у простого биуретового комплекса, поэтому метод чувствительнее. Плата — зависимость от ароматических остатков и длинный список помех: фенолы, тиолы, часть буферов, детергенты, ЭДТА и восстановители. Два белка одной массы, но разного содержания тирозина, не обязаны дать одну оптическую плотность.

Бицинхониновый метод, BCA, тоже начинается с щелочной меди, но измеряет не фиолетовый комплекс Cu²⁺, а Cu⁺, который белок восстановил. Пептидные связи, цистеин, тирозин и триптофан участвуют в восстановлении. Cu⁺ с бицинхониновой кислотой даёт пурпурный комплекс с максимумом около 562 нм. Сигнал интенсивнее классического биуретового, часть детергентов мешает меньше, чем методу Брэдфорда. Восстановители сами производят Cu⁺ и завышают результат. Хелаторы меди его гасят. Путать BCA с «просто более ярким биуретом» не стоит: регистрируется другая частица.

Краситель, ультрафиолет и азот

Метод Брэдфорда использует Кумасси бриллиантовый синий G-250 в кислой среде. Свободный краситель имеет максимум около 470 нм и выглядит красно-коричневым. На белке стабилизируется синяя анионная форма с максимумом около 595 нм. Связывание идёт прежде всего с аргинином, слабее с другими основными и ароматическими остатками. Поэтому белок, богатый аргинином, даёт более сильный цвет, чем бедный аргинином белок той же массы. Метод быстрый. Детергенты, особенно додецилсульфат натрия, мешают, потому что сами взаимодействуют с красителем или закрывают места связывания. Короткие пептиды полноценного ответа обычно не дают: им нечем удержать краситель так, как глобуле.

Поглощение при 280 нм создают триптофан и тирозин; фенилаланин в этой точке поглощает слабо. Пептидная связь поглощает дальше, около 190–220 нм, где мешают многие буферы, поэтому в учебной лаборатории пользуются 280 нм. Метод не разрушает образец и не требует реактива. Коэффициент поглощения у каждого белка свой. Коллаген, бедный ароматикой, будет недооценён, если считать его как сывороточный альбумин. Нуклеиновые кислоты поглощают около 260 нм и завышают белковое поглощение; по отношению A280/A260 вносят поправку. Это оценка, а не замена калибровки для точной массы.

Метод Кьельдаля измеряет азот. Образец сжигают концентрированной серной кислотой с катализатором, органический азот переходит в сульфат аммония. После подщелачивания аммиак отгоняют и титруют. В белок результат превращают умножением на коэффициент. Коэффициент 6,25 происходит из допущения, что в белке около 16% азота: 100/16 = 6,25. Это среднее соглашение, не состав конкретной молекулы. По данным FAO, азот белков лежит примерно в диапазоне 13–19%. Для молока используют фактор около 6,38, для эндосперма пшеницы — 5,70, для мяса и яиц — 6,25. Кроме того, метод видит небелковый азот: мочевину, свободные аминокислоты, нуклеотиды, креатин. Он завысит «белок», если в образце много таких веществ. Метод разрушает пробу и для маленького клинического образца неудобен. Сжигание по Дюма тоже измеряет азот и несёт ту же проблему пересчёта. Сумма аминокислот после гидролиза ближе к массе настоящих аминокислотных остатков, но триптофан и серосодержащие остатки определять труднее, а оборудование сложнее. FAO считает такой подсчёт предпочтительным для пищевых таблиц, когда он доступен, и оставляет азотный фактор запасным путём.

Конкретный белок и выбор метода

Антитело узнаёт один белок или одну группу эпитопов. Помутнение или рассеяние света иммунным комплексом — турбидиметрия и нефелометрия — пропорционально количеству этого белка в рабочем диапазоне. Иммуноферментный анализ отвечает на тот же вопрос другим сигналом. Это не общий белок. Альбумин и общий белок сыворотки могут расходиться, и оба результата будут аналитически верными.

Выбор следует из вопроса и из помех.

• Общий белок при высокой концентрации и желании меньшей зависимости от состава — биуретовый метод. Поэтому им обычно измеряют общий белок сыворотки.

• Мало белка, можно разрушить образец и проверить помехи — Лоури, BCA или Брэдфорд. Сначала смотрят, нет ли детергента, восстановителя или фенола.

• Образец нужно сохранить — 280 нм, если известен коэффициент или допустима грубая оценка.

• Азот пищевого образца — Кьельдаль или Дюма с понятным фактором и с оговоркой о небелковом азоте.

• Один названный белок — иммунохимический метод.

• Поиск белка в моче — сначала осадительная качественная проба; количество потом измеряют методом, который видит низкую концентрацию. Осадок сам по себе не есть цифра.

Ни один из этих методов не устанавливает последовательность и не доказывает нативную четвертичную структуру. Секвенирование и цветная проба отвечают на разные вопросы. Если преподаватель спрашивает «как доказать, что в растворе белок», начинают с биуретовой реакции и оговаривают, что свободные аминокислоты её не дают. Если спрашивает «как узнать, сколько его», называют, что именно будет стоять в числителе: пептидные связи, аргинин, азот или эпитоп.

11На экзамене

12Частая ошибка