Физико-химические свойства белков. Методы выделения и очистки белков. Простые белки

01От чего зависят физико-химические свойства белков

Физико-химические свойства белка в растворе — это не отдельный список «признаков коллоида», а прямое следствие трех вещей: размера молекулы, ее формы и того, какие группы выставлены на поверхность. Первичная структура, спирали, складки и глобула подробно разбираются в теме строения. Здесь они нужны только как граница. Пока пептидные связи целы, последовательность задает, какая укладка вообще возможна. Саму укладку держат слабые взаимодействия и, у многих белков, дисульфидные связи. Если укладка нативная, полярные и заряженные остатки преимущественно смотрят в воду, а гидрофобные спрятаны внутрь. Если укладка разрушена, картина растворимости меняется, хотя химическая формула цепи та же.

Белок — макромолекула. Его водный раствор является молекулярным раствором высокомолекулярного вещества, а не взвесью чужеродных мицелл. При этом частицы настолько крупны, что раствор проявляет свойства, которые раньше описывали только у коллоидных золей: медленно диффундирует, рассеивает свет, не проходит через обычную полупроницаемую мембрану и часто заметно вязкий. На экзамене ждут именно эти коллоидные свойства. Точная формулировка такая: это молекулярный раствор макромолекул с коллоидными свойствами, а не классический коллоид в старом абсолютном смысле.

Из этого следуют две рабочие оси всей темы. Поверхность объясняет заряд, гидратацию, растворимость, высаливание, ионообмен и электрофорез. Размер и форма объясняют диализ, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, осаждение в центрифуге и разделение в полиакриламидном геле. Метод очистки ничего не «узнает» о биологическом имени белка. Он отделяет молекулы только потому, что они различаются по одному из этих признаков: растворимости, заряду, гидродинамическому размеру, плотности, гидрофобности поверхности или способности связать конкретный лиганд.

Поэтому устный ответ логично строить так. Сначала назвать, чем раствор белка отличается от раствора соли. Затем объяснить устойчивость раствора через заряд и гидратацию, изоэлектрическую точку и денатурацию. Потом показать, что каждый метод выделения использует одно из этих различий, и только в конце разложить простые белки по растворителям. Цветные реакции — биуретовая, нингидриновая, ксантопротеиновая и другие — относятся к качественному анализу и здесь не нужны: они доказывают состав, а не разделяют смесь.

02Растворимость и устойчивость белкового раствора

Растворимость — не ярлык, навсегда пришитый к названию белка. Один и тот же полипептид может быть растворим в разбавленной соли и нерастворим в чистой воде, выпасть при подкислении и снова раствориться после возврата pH, если укладка не погибла. Растворимость зависит от растворителя, pH, ионной силы, температуры и того, нативна ли молекула.

Глобулярный белок удерживается в воде по двум причинам. На поверхности лежат полярные и ионизируемые группы. Они образуют водородные связи и ион-дипольные контакты с водой, и вокруг глобулы возникает гидратная оболочка. Одноименный суммарный заряд соседних молекул создает отталкивание, поэтому глобулы не слипаются. Гидрофобные остатки в нативном белке в основном спрятаны. Если они оказываются снаружи — после денатурации или у мембранного белка, — сродство к воде падает.

Отсюда правило, на котором стоят все осадочные методы. Устойчивость белкового раствора держат два фактора: заряд и гидратация. Снять один — раствор становится менее устойчивым, но белок еще может остаться в растворе. Снять оба — молекулы агрегируют и выпадают. Высаливание, изоэлектрическое осаждение и осаждение спиртом — разные способы подорвать именно эту пару факторов, а не разные «химические реакции на белок».

При низкой ионной силе небольшие ионы экранируют заряженные участки. Это всаливание: растворимость многих белков растет. Особенно заметно оно у глобулинов. У них на поверхности есть участки разного знака, и в чистой воде молекулы цепляются друг за друга. Разбавленный нейтральный раствор соли экранирует эти участки, и глобулин растворяется. Альбумин и без соли достаточно гидратирован и заряжен, поэтому растворяется уже в воде. Всаливание и высаливание — не противоречие, а два конца одной кривой. Мало соли помогает растворению, много соли отнимает воду и гасит отталкивание.

Охлаждение при выделении нужно прежде всего затем, чтобы замедлить денатурацию и работу протеаз, которые выходят из разрушенных клеток. Это не закон «чем холоднее, тем белок растворимее». Нагревание повышает кинетическую энергию, рвет слабые связи и часто заканчивается денатурацией, а уже потом — выпадением осадка. Форма действует в ту же сторону, что и поверхность. Палочковидная молекула контактирует с водой и с соседними цепями на большой длине, повышает вязкость и обычно плохо растворима. Так устроены протеиноиды, о которых речь пойдет отдельно.

В крови при физиологическом pH и ионной силе альбумины и большинство глобулинов остаются в растворе. Сдвиг к изоэлектрической точке или потеря гидратации делает осаждение более вероятным, но сам по себе нормальный pH плазмы не является условием осаждения.

03Амфотерность, заряд и изоэлектрическая точка

Белок — полиамфолит, а не одна аминокислота. Заряд складывается из концевой карбоксильной группы, концевой аминогруппы и боковых цепей. Кислый вклад дают аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Основной — лизин, аргинин и гистидин. Цистеин и тирозин тоже могут отдавать протон, но в более щелочной области. Аспарагин и глутамин заряженного вклада не дают: амид — не карбоксилат. Суммарный заряд — алгебраическая сумма всех этих групп, а не заряд «главной» группы.

Изоэлектрическая точка, pI, — это pH среды, при котором суммарный заряд данной молекулы равен нулю. Это свойство белка в данных условиях, а не pH той склянки, где его случайно хранят. В pI заряженные группы никуда не исчезают. Положительных зарядов столько же, сколько отрицательных, поэтому молекула в электрическом поле не движется ни к аноду, ни к катоду.

Знак заряда читается сравнением pH и pI. Если pH ниже pI, группы протонированы сильнее, суммарный заряд положителен, белок ведет себя как катион и движется к катоду — отрицательному электроду. Если pH выше pI, суммарный заряд отрицателен, белок — анион и движется к аноду — положительному электроду. Путаница электродов — частая потеря балла: катод притягивает катионы, анод притягивает анионы.

В pI растворимость обычно минимальна, потому что исчезает электростатическое отталкивание и молекулам легче слипнуться. Это типичная закономерность, а не закон для каждого белка. Толстая гидратная оболочка может удержать молекулу в растворе и при нулевом суммарном заряде. Альбумины как раз сильно гидратированы, поэтому одного доведения pH до pI часто мало, и осадок получают, добавляя соль или другой водоотнимающий агент. Фраза «любой белок в изоэлектрической точке обязательно выпадает» на экзамене неверна.

pI белка нельзя считать по формуле простой аминокислоты 0,5(pK1 + pK2). Та формула описывает амфолит с двумя ионизируемыми группами. У белка групп много, их pKa сдвинуты окружением, и pI — это тот pH, где сумма всех частичных зарядов проходит через ноль. Ее измеряют, например, изоэлектрофокусированием, а не выводят из двух констант.

Белок с избытком аспарагиновой и глутаминовой кислот имеет кислую pI. Белок с избытком лизина и аргинина — щелочную. При pH крови, около 7,4, большинство белков плазмы несет отрицательный заряд, потому что их pI ниже этого pH, и на электрофорезе сыворотки они идут к аноду. Это не значит, что всякий белок организма — анион: гистоны при том же pH положительны.

Сывороточный альбумин — кислый белок. Его pI лежит заметно ниже pH крови, поэтому в плазме он сильно отрицателен и на электрофорезе обгоняет остальные фракции. Точное число pI зависит от связанных жирных кислот и от метода измерения, поэтому заучивать одну цифру как физическую константу не нужно. Экзаменационный факт — кислая точка и отрицательный заряд при физиологическом pH.

Буферные свойства с pI путать нельзя. Каждая ионизируемая группа буферирует вблизи своего pKa, а не в изоэлектрической точке. У простой аминокислоты буферная емкость как раз минимальна около pI и максимальна около pKa. Белок буферирует потому, что групп много и их pKa разбросаны; заметный вклад около нейтрального pH дает гистидин. Белки плазмы участвуют в буферной емкости крови, но не заменяют гидрокарбонатную систему и гемоглобин. Это следствие амфотерности, а не отдельная тема кислотно-основного состояния.

Заряд меняют и химические модификации. Фосфорилирование добавляет отрицательный заряд и может сдвинуть pI вниз. Ацетилирование лизина снимает положительный заряд. Поэтому изоформы одного белка с разным набором модификаций расходятся при изоэлектрофокусировании, хотя масса цепи почти та же.

04Высаливание, осаждение и денатурация

Высаливание

Высаливание — осаждение белка высокой концентрацией нейтральной соли. На практике почти всегда берут сульфат аммония. Он очень хорошо растворим, для большинства белков относительно мягок, а сульфат относится к сильным высаливающим анионам. Ионы соли оттягивают воду на себя и тем самым разрушают гидратную оболочку. Одновременно ионная атмосфера экранирует оставшийся заряд. Оба фактора устойчивости слабеют, гидрофобные участки разных молекул встречаются, и белок агрегирует.

Порог у каждого белка свой: он зависит от гидратации и гидрофобности поверхности. Слабее гидратированный белок выпадает раньше. На этом основано фракционирование. Классическое лабораторное правило классов такое: глобулины осаждаются при полунасыщении раствора сульфатом аммония, альбумины — при полном насыщении. Это правило растворимости двух учебных классов, а не гарантия для всякого белка, который в бланке электрофореза назван глобулином.

Если укладка сохранилась, высаливание обратимо. Соль убирают диализом или обессоливанием на геле, осадок растворяют, биологическая активность возвращается. Поэтому высаливание — метод грубой очистки, а не денатурация и не цветная проба.

Изоэлектрическое осаждение и органические растворители

Изоэлектрическое осаждение доводит pH до pI конкретного белка. Отталкивание исчезает, и при недостаточной гидратации белок выпадает. Соседние белки с другой pI в этот момент еще заряжены и остаются в растворе. Метод разделяет именно по различию pI, а не по массе.

Этанол и ацетон снижают диэлектрическую проницаемость воды. Разноименные заряды на соседних молекулах притягиваются сильнее, а растворитель конкурирует за гидратную воду. Разные белки выпадают при разной доле растворителя, разном pH и разной ионной силе. При комнатной температуре это часто сопровождается денатурацией. На холоду, как в классическом спиртовом фракционировании плазмы, осаждение можно провести так, чтобы нативная структура пострадала меньше. Поэтому утверждение «спирт всегда необратимо денатурирует белок» неверно: решает температура и режим, а не одно только имя растворителя.

Что такое денатурация

Денатурация — утрата нативной конформации. Рвутся слабые связи: водородные, ионные, гидрофобные контакты, ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Дисульфидные связи разрушаются только если агент на это способен, например восстановитель. Пептидные связи при денатурации не гидролизуются. Первичная структура сохраняется. Именно поэтому ренатурация в принципе возможна.

Следствия понятны из механизма. Биологическая активность — катализ, связывание лиганда, гормональный эффект — пропадает, потому что активная поверхность собрана укладкой. Гидрофобные остатки выходят наружу, растворимость обычно падает, цепи слипаются. Удельное вращение меняется, потому что исчезает асимметрия спиралей. Протеазам легче атаковать развернутую цепь. Вязкость часто растет: компактная глобула превращается в более вытянутый рыхлый клубок. Но денатурация не равна осаждению. Мочевина, гуанидинхлорид и додецилсульфат натрия разворачивают цепь и при этом могут удержать ее в растворе. SDS делает это за счет оболочки из отрицательного заряда: молекулы отталкиваются, хотя уже не нативны.

Агенты действуют по-разному. Нагревание повышает энергию теплового движения и рвет слабые связи. Крайние pH меняют ионизацию и создают внутреннее отталкивание. Длительное кипячение в крепкой кислоте или щелочи — уже другой процесс, гидролиз пептидных связей; его нельзя называть денатурацией. Мочевина и гуанидинхлорид конкурируют за водородные связи и ослабляют гидрофобный эффект. SDS садится на гидрофобные участки и облепляет цепь отрицательным зарядом. Органический растворитель при комнатной температуре портит и гидрофобное ядро, и водородные связи. Ионы тяжелых металлов связываются с тиолами и карбоксилатами, искажают укладку и могут сшивать молекулы. Встряхивание и пена денатурируют за счет адсорбции на границе вода–воздух: цепь разворачивается на поверхности.

Ренатурация удается, если первичная структура цела и цепи не успели схватиться в неразборный агрегат. Классический пример — рибонуклеаза, которая после удаления денатуранта и восстановления условий снова сворачивается. Это не обещание для всякого белка. Крупные многодоменные и многосубъединичные белки, которым в клетке нужны шапероны, сами часто не возвращаются. Верная формула: денатурация не всегда необратима и не всегда обратима.

Медицинский смысл тот же механизм. При варке пищи белки разворачиваются, и протеазам пищеварения их легче резать. Нагревание и спирт повреждают белки микробов, на этом основано обеззараживание. Кипячение и кислотное осаждение выявляют белок в моче. Это иллюстрации свойства, а не схемы лечения.

Осадочные реакции

Цветные реакции здесь не разбираются. Осадочные реакции — другое: они следуют из заряда и денатурации.

Альбумины и глобулины при нагревании, особенно вблизи pI или после слабого подкисления, денатурируют и свертываются. На этом построена проба кипячения на белок мочи. Гистоны, протамины и желатин такого плотного свертывания обычно не дают.

Крепкие минеральные кислоты и ряд органических кислот, в том числе трихлоруксусная и сульфосалициловая, денатурируют белок и осаждают его. Сульфосалициловая кислота — обычный реактив на белок в моче.

Соли тяжелых металлов — меди, свинца, ртути, серебра — дают малорастворимые комплексы с белком-анионом. Реакция идет, когда pH выше pI и белок отрицателен. Катион металла связывается с отрицательными группами. Ставить эту пробу на кислой стороне от pI бессмысленно: белок там сам катион.

Алкалоидные реактивы — танин, пикриновая кислота, фосфорновольфрамовая и фосфорномолибденовая кислоты — крупные анионы. Они осаждают белок-катион, то есть при pH ниже pI. Путать сторону pI у тяжелых металлов и у алкалоидных реактивов — стандартная ошибка.

Связывание тяжелых металлов с белками объясняет, почему эти соли являются осадителями. Это химический факт. Он не является рекомендацией какого-либо домашнего антидота.

05Диффузия, онкотическое давление и оптические свойства

Крупная молекула испытывает большое трение о растворитель, поэтому белок диффундирует гораздо медленнее соли. Малые ионы за то же время проходят через поры мембраны, белок — нет. На этом единственном различии размера стоят диализ и вся идея коллоидно-осмотического давления. Ни заряд, ни биологическая функция здесь ни при чем: мембрана не «выбирает альбумин», она не пускает все, что крупнее ее пор.

Белок не проходит через стенку обычного капилляра так свободно, как вода и соли. Вода стремится в сторону, где остались макромолекулы. Это коллоидно-осмотическое, или онкотическое, давление. Вклад белков в общее осмотическое давление плазмы невелик: их молярная концентрация намного ниже, чем у натрия и хлорида. Но через стенку сосуда соли успевают уравновеситься, а белки — нет. Поэтому именно онкотическое давление удерживает воду в сосудистом русле. Основную долю этого давления создает альбумин. Его молекулы мельче большинства глобулинов и их больше по числу, хотя речь идет об одном и том же массовом сравнении фракций. Падение концентрации альбумина снижает онкотическое давление и способствует отеку. Процент этой доли и давление в миллиметрах ртутного столба зависят от условий измерения; для экзамена достаточно механизма и того, что альбумин — главный участник.

Вязкость раствора зависит от концентрации, гидратации и особенно от асимметрии частиц. Палочка захватывает вокруг себя больше растворителя, чем шар той же массы. Поэтому фибриллярные белки и уже развернутые денатурированные цепи повышают вязкость сильнее, чем компактные глобулы. Для методов разделения это важно: гель-фильтрация чувствует гидродинамический объем, а не массу, написанную в таблице. Два белка одной массы, но разной формы выходят не строго вместе.

Раствор белка рассеивает свет, потому что частицы крупны по сравнению с молекулами соли. Это свойство мутной макромолекулярной системы, а не специфическая проба на данный белок. Опалесценция не доказывает ни чистоту, ни денатурацию.

Оптическая активность складывается из двух источников. Асимметрические атомы углерода L-аминокислот вращают плоскость поляризации сами по себе. Нативная укладка, особенно спиральные участки, добавляет свою асимметрию. Когда укладка разрушается, удельное вращение меняется. Исторически по этому сдвигу следили за денатурацией. Число градусов здесь не нужно: важен знак причины.

Поглощение света тоже разложено по группам. Пептидные связи поглощают в дальнем ультрафиолете. Триптофан и тирозин, слабее фенилаланин, поглощают около 280 нм. Поэтому фракции, выходящие с колонки, часто следят по поглощению при 280 нм. Метод слеп к белку, в котором почти нет этих остатков: коллаген и желатин как раз бедны ароматическими аминокислотами и триптофаном. Количественные окрашенные методы — отдельная тема анализа. Здесь нужен физический смысл: 280 нм — свойство ароматических остатков, а не универсальный «цвет белка».

Белок амфифилен, поэтому садится на границу раздела фаз, дает пену и там же может денатурировать. Сильное встряхивание раствора при очистке — не безобидное перемешивание.

Коротко о равновесии Доннана. Белок — макроион, который не проходит через мембрану. На равновесии малые ионы по двум сторонам мембраны распределяются не поровну: их тянет недиффундирующий заряд белка. Поэтому осмотическое давление и концентрации соли внутри и снаружи диализного мешка нельзя объяснить одним только числом белковых частиц. Для экзамена достаточно понимать, что диализ убирает основную массу соли, но не делает внутренний и наружный растворы мгновенно одинаковыми по каждому иону.

06Как выделяют белок и как доказывают, что он один

Цель выделения — получить один белок, по возможности нативный и активный, из смеси тысяч других. Ни один метод не смотрит на название. Каждый использует одно различие: растворимость, заряд, размер и форму, плотность, гидрофобность поверхности или специфическое связывание. Одного различия почти никогда не хватает, потому что в клетке всегда найдется сосед с похожим зарядом или похожей массой. Методы складывают.

Практический порядок такой. Берут ткань или жидкость, где нужного белка много, и не тащат весь организм. Клетки разрушают осторожно и на холоду: гомогенизацией, ультразвуком, замораживанием и оттаиванием, детергентом или ферментом вроде лизоцима. Из разрушенных лизосом выходят протеазы, поэтому работают быстро, держат холод и при необходимости добавляют ингибиторы протеаз. Экстракт подбирают по растворимости нужного белка. Обломки клеток снимают центрифугированием. Дальше идет грубое, но емкое фракционирование — высаливание, изоэлектрическое или холодное спиртовое осаждение. Затем методы высокого разрешения: ионообмен, гель-фильтрация, аффинная хроматография. Соль убирают, раствор концентрируют и доказывают однородность.

Порядок не ритуал. Ранние шаги дешевы и переваривают литры мутного экстракта. Поздние шаги разделяют тоньше, но дороже и рассчитаны на меньший объем. Если есть специфический лиганд, аффинную хроматографию можно поставить раньше: избирательность заменяет несколько грубых ступеней. Препаративная очистка гонится за количеством и сохраненной активностью. Аналитический электрофорез часто денатурирует пробу и нужен, чтобы увидеть состав, а не чтобы наработать белок.

Если белок — фермент, очистку ведут по активности, а не по внешнему виду осадка. Считают общую активность, общее количество белка и удельную активность — активность на единицу массы белка. Удельная активность растет, когда уходят чужие белки. Выход — какая доля исходной активности сохранилась; он обычно падает, потому что часть целевого белка теряется на каждом шаге. Степень очистки — во сколько раз выросла удельная активность. Шаг, который «очищает» до нуля активности, для нативного фермента бесполезен. Типичные кратности здесь не заучивают: они зависят от исходной смеси и от белка.

Однородность не доказывается одним опытом. Один белок должен давать одну полосу при электрофорезе, причем лучше двумя разными методами: в SDS-геле по массе и при изоэлектрофокусировании по pI. Два белка могут совпасть по массе и разойтись по pI, или наоборот. На хроматограмме ждут один пик. Удельная активность должна быть постоянной по фракциям пика и не расти от следующей ступени. У одноцепочечного белка один N-концевой остаток; несколько N-концов означают либо примесь, либо несколько субъединиц. В ультрацентрифуге однородная проба дает одну границу осаждения. Кристаллизация поддерживает чистоту, но не доказывает ее: кристалл может захватить примесь, а чистый белок может не кристаллизоваться вовсе.

Хранят очищенный белок на холоду, при подходящем pH и ионной силе, иногда с глицерином, без повторного замораживания-оттаивания и без пены. Это уже следствие тех же свойств: денатурация и протеолиз, а не отдельный ритуал.

07Методы, которые разделяют по растворимости и размеру

Экстракция

Уже выбор растворителя разделяет белки, потому что классы растворимы в разном. Альбумины переходят в воду. Глобулины — в разбавленную нейтральную соль. Гистоны — в разбавленную кислоту. Проламины — в водный этанол высокой концентрации. Глютелины — в разбавленную кислоту или щелочь. Протеиноиды этими растворителями не извлекаются и остаются в тканевом остатке. Дифференциальная экстракция — не подготовка «до методов», а первый метод.

Мембранный белок в воде не всплывет: его поверхность гидрофобна и сидит в липиде. Нужен детергент. Додецилсульфат натрия мембрану растворит, но белок денатурирует. Более мягкие детергенты могут удержать нативную укладку. Это граница темы, а не каталог торговых марок.

Высаливание как фракционирование

Соль добавляют ступенями и собирают осадки. Каждый осадок — белки, потерявшие растворимость в данном узком окне ионной силы. Осадок растворяют и освобождают от соли. Разделение происходит потому, что кривые растворимости разных белков не совпадают. Разрешение грубое: в одной фракции остаются десятки белков. Зато метод берет большой объем и не требует колонки.

Изоэлектрическое и спиртовое осаждение

Сдвиг pH к pI убирает отталкивание у одного белка раньше, чем у другого. Холодный этанол или ацетон меняет диэлектрическую проницаемость и гидратацию; белки выпадают при разной доле растворителя. Оба метода делят по растворимости, но рычаг разный: в одном случае pH, в другом — свойства растворителя. Тепло при спиртовом осаждении повышает риск денатурации, поэтому фракционирование плазмы ведут на холоду.

Диализ

Диализный мешок пропускает воду и малые растворенные вещества и задерживает белок. Движущая сила — диффузия. Соль уходит, белок остается. Метод отделяет макромолекулы от низкомолекулярных примесей после высаливания. Он не разделяет альбумин и глобулин: оба не проходят через поры. Диализ медленный и сам по себе почти не концентрирует раствор, если снаружи не создан водоотнимающий агент. Из-за равновесия Доннана концентрации ионов по сторонам мембраны не становятся мгновенно одинаковыми.

Ультрафильтрация

Здесь растворитель и малые молекулы продавливают через мембрану давлением или центрифугированием. Номинальный порог отсечения задерживает белки крупнее этого порога и заодно концентрирует раствор. Разделение снова по размеру, но порог не острый: близкие по массе белки мембрана не рассортирует. Ультрафильтрация не заменяет гель-фильтрацию, если нужно развести два белка, и не заменяет диализ по принципу, хотя обе операции убирают соль.

Центрифугирование

В центробежном поле частица осаждается тем быстрее, чем больше ее масса и плотность и чем меньше трение, то есть чем компактнее форма. Дифференциальное центрифугирование поэтому сначала снимает клетки и ядра, затем митохондрии и микросомы, а растворимые белки остаются в надосадочной жидкости. Это разделение органелл и крупных частиц, а не тонкая очистка двух глобулинов.

Ультрацентрифугирование доходит до макромолекул. В градиенте плотности есть два разных опыта, и их путают. Зонально-скоростное центрифугирование разделяет по скорости осаждения: частицы проходят разный путь за одно время. Равновесное, изопикническое, останавливает частицу там, где ее плавучая плотность совпала с плотностью среды. Обычные растворимые белки близки по плотности, поэтому равновесное разделение по плотности для них гораздо слабее, чем для органелл и нуклеиновых кислот. Для самих белков рабочими остаются скорость осаждения, растворимость, заряд и размер на колонке. Ультрацентрифуга не является рутинным способом получить каждый индивидуальный белок.

08Хроматография: почему белки выходят в разное время

В любом хроматографическом методе подвижная фаза течет сквозь неподвижную. Белки проводят разное время на матрице или внутри пор, поэтому выходят разными фракциями. Фракции часто следят по поглощению около 280 нм. Высокое давление и мелкие зерна превращают тот же принцип в ВЭЖХ: растет разрешение, но физический признак разделения не меняется. ВЭЖХ — не отдельный закон природы, а техника ионообмена, обращенной фазы, гель-фильтрации или аффинности.

Ионообменная хроматография

Она разделяет по суммарному заряду при выбранном pH. Катионообменник, например карбоксиметилцеллюлоза, несет отрицательную матрицу и связывает катионы — белки при pH ниже их pI. Анионообменник, например ДЭАЭ-целлюлоза, несет положительную матрицу и связывает анионы — белки при pH выше их pI. Белок неверного знака не садится и вымывается сразу. Связавшиеся белки снимают градиентом соли: ионы соли конкурируют за матрицу, и слабее заряженный белок уходит раньше. Можно сдвинуть pH так, чтобы заряд белка упал и он сам отпустил матрицу.

Название путает. В слове ДЭАЭ есть «амино», но диэтиламиноэтильная группа протонирована и положительна, поэтому это анионообменник. Карбоксиметил заряжен отрицательно и держит катионы. Запомнить нужно не слог, а знак матрицы.

Гель-фильтрация

Гель-фильтрация, или эксклюзионная хроматография, разделяет по гидродинамическому размеру. В зернах есть поры. Крупный белок в поры не входит, идет только между зернами, по короткому пути, и выходит первым. Мелкий белок заходит в поры, путь длиннее, выходит позже. Соли выходят последними. Поэтому та же колонка обессоливает белок после высаливания: белок в свободном объеме, соль в полном. Мягкий буфер укладку не разрушает. Разрешение скромное: белки должны заметно различаться по размеру. Масса из таблицы не равна гидродинамическому объему, если форма разная.

Аффинная хроматография

Здесь матрица несет лиганд, который узнает только нужный белок: аналог субстрата, антитело, лектин для гликопротеина, ион металла для гистидиновой метки. Остальные белки проходят не задерживаясь. Снимают белок конкурентом, сдвигом pH или солью, которые ослабляют связывание. Разделение происходит потому, что центр связывания есть только у одной молекулы, а не потому, что она крупнее или кислее. Избирательность выше, чем у заряда и размера. Центр должен сохраниться, поэтому жесткий денатурант до элюции не применяют. Метка из нескольких гистидинов и никелевая колонка — тот же принцип, только лиганд создан искусственно.

Гидрофобная и обращенно-фазовая хроматография

Гидрофобная хроматография делит белки по гидрофобности поверхности. В высокой соли вода занята ионами, и гидрофобный контакт с матрицей становится выгодным — это родственник высаливания. Снимают белок, понижая соль, то есть в порядке, обратном ионообмену. Метод удобен сразу после сульфата аммония и обычно мягче, чем обращенная фаза.

Обращенно-фазовая ВЭЖХ тоже чувствует гидрофобность, но элюирует растущей долей органического растворителя. Разрешение высокое, укладка часто гибнет. Для пептидов и аналитической работы это приемлемо, для нативного фермента — часто нет. Адсорбция на гидроксиапатите и сходных носителях разделяет по тому, как узор зарядов поверхности ложится на адсорбент. Это не размер и не специфический биологический лиганд.

09Электрофорез: заряд, размер и изоэлектрическая точка

Заряженная частица в электрическом поле движется к электроду противоположного знака. Скорость зависит от суммарного заряда, от трения — то есть от размера и формы — и от среды. Если среда еще и ситует, как гель, размер начинает решать не меньше, чем заряд. Разные варианты электрофореза устроены так, чтобы оставить в игре только один из этих вкладов.

Зональный электрофорез на бумаге или ацетате целлюлозы разделяет в основном по заряду, с небольшой добавкой адсорбции на носителе. Сыворотку в учебной работе часто гонят в слабощелочном буфере. Большинство белков плазмы там — анионы и идут к аноду. Альбумин самый быстрый: заряд большой, молекула относительно небольшая. За ним идут группы α1, α2 и β. Гамма-глобулины движутся медленнее всех и остаются ближе к старту. Это группы подвижности, а не индивидуальные белки. Одна полоса альбумина не доказывает, что в ней нет минорных примесей, если метод грубый.

Нативный электрофорез в полиакриламидном геле сохраняет заряд и форму белка. Гель дополнительно тормозит крупные молекулы. Разделение смешанное: и заряд, и размер. Активность может сохраниться. Два разных белка способны лечь в одну зону.

SDS-электрофорез устроен иначе, и это частый экзаменационный вопрос. Додецилсульфат натрия денатурирует белок и садится вдоль цепи, сообщая ей большой отрицательный заряд, примерно пропорциональный длине. Удельная плотность заряда у разных полипептидов становится сходной. Собственная pI перестает решать. Гель ситует по размеру, и дальше уходит более короткий полипептид. Восстановитель рвет дисульфидные связи, и субъединицы расходятся; без восстановителя сшитый дисульфидами белок может идти одной частицей. Метод делит по массе после выравнивания заряда. Он уничтожает нативную активность. Гликопротеины и некоторые необычные белки мигрируют аномально, поэтому показание массы — оценка, а не всегда точный паспорт.

Изоэлектрофокусирование разделяет по pI. В геле или капилляре создан градиент pH. Белок движется, пока не попадает в зону, где pH равен его pI. Там суммарный заряд становится нулем, и движение прекращается. Белок фокусируется в узкой полосе, даже если стартовал размазанным. Изоформы с разным зарядом, которые в SDS-геле слились бы по массе, здесь расходятся.

Двумерный электрофорез ставит эти принципы друг за другом. Сначала изоэлектрофокусирование по pI, затем SDS-электрофорез по массе. Белки, совпавшие в одном измерении, часто расходятся в другом. Это аналитическая карта, а не способ наработать граммы белка.

Электрофорез в основном аналитический. Препаративное вырезание полосы существует, но это не емкий первый шаг очистки. Направление поля нужно проговаривать явно. Анод положителен, катод отрицателен. В слабощелочном буфере белки плазмы — анионы и движутся к аноду.

10Простые белки: определение и классификация

Простой белок построен только из остатков аминокислот. При полном гидролизе он дает только аминокислоты и не оставляет небелкового компонента. Сложный белок при том же гидролизе дает аминокислоты и простетическую группу. Классы сложных белков — следующая тема. Здесь нужна только граница, чтобы не записать в простые белки то, что простым не является.

В старых русских учебниках простые белки называли протеинами, а сложные — протеидами. В современном языке слово «protein» означает любой белок. Если преподаватель говорит «протеины», в этом билете он имеет в виду простые белки, а не белки вообще.

Экзаменационная классификация простых белков — классическая классификация по растворимости, восходящая к работам Осборна. Это не современная классификация по семействам последовательностей, типу укладки или функции. Сиквенс иногда переносит белок из старого растворимого класса в другое семейство. На экзамене классы все равно различают по растворителю. Группы такие: альбумины, глобулины, проламины, глютелины, гистоны, протамины и протеиноиды, или склеропротеины. Принцип один. У каждой группы есть растворитель, который ее отличает, типичный уклон аминокислотного состава и типичная биологическая роль. Растворитель — первичный экзаменационный критерий.

Три ловушки обязательны.

Гистон как полипептид — простой белок: в его цепи нет простетической группы. Тот же гистон, связанный с ДНК, — нуклеопротеин, то есть сложный белок. Спрашивают часто именно это.

Многие белки плазмы, которые по высаливанию и по электрофорезу называют глобулинами, содержат углевод, липид или металл и химически относятся к сложным белкам. Класс растворимости «глобулин» и химический класс «простой белок» — не одно и то же множество. Сывороточный альбумин не гликозилирован и является ясным простым белком.

Часть молекул коллагена несет небольшой углевод на гидроксилизине. Учебник все равно ставит коллаген в протеиноиды: это не крупная простетическая группа типичного гликопротеина. Абсолют «каждый коллаген состоит только из аминокислот» поэтому не ставят, но экзаменационное место коллагена — среди протеиноидов.

Глютелины когда-то отделили от проламинов по растворимости. По последовательностям их часто считают плохо растворимой ветвью проламинов. На экзамене их оставляют разными классами, потому что растворители разные.

11Альбумины и глобулины

Альбумины

Альбумины растворимы в воде и в разбавленных растворах солей. Они сильно гидратированы, поэтому для высаливания им нужно полное насыщение сульфатом аммония: воду приходится отнять почти полностью. В составе много аспарагиновой и глутаминовой кислот, pI кислая. При pH крови альбумин — анион и на электрофорезе сыворотки движется к аноду быстрее остальных фракций: заряд велик, а молекула относительно невелика. При нагревании альбумины свертываются.

Примеры класса — сывороточный альбумин, овальбумин яйца, лактальбумин молока. В семенах растений тоже есть запасные альбумины. Это один класс растворимости, а не один ген.

Сывороточный альбумин — самый массовый белок плазмы, около половины белка сыворотки. Его синтезирует печень. Молекула глобулярная и мономерная. Справочники дают массу порядка 66–67 кДа, учебные таблицы часто округляют шире, до 65–70 кДа. Для экзамена важно не сражение за один дальтон, а то, что альбумин мельче большинства глобулиновых фракций и поэтому при той же массе белка создает больше частиц. Много дисульфидных связей держит глобулу устойчивой; это пояснение стабильности, а не лекция о доменах.

Функции прямо вытекают из свойств. Онкотическое давление велико, потому что молярная концентрация высока и нормальная капиллярная стенка не пропускает альбумин так же свободно, как соль. На поверхности есть участки связывания, поэтому альбумин переносит жирные кислоты, билирубин, часть гормонов и лекарств. Как полиамфолит он участвует в буферной емкости плазмы. Аминокислоты альбумина — резерв для тканей. Отрицательный заряд и размер мешают здоровому клубочку выводить его в мочу. При гипоальбуминемии падает онкотическое давление и легче возникает отек. Перечень болезней здесь не нужен: нужен механизм.

Глобулины

Глобулины плохо растворимы или нерастворимы в чистой воде и растворяются в разбавленных нейтральных солях. Это прямое следствие всаливания. Гидратированы они слабее альбуминов, поэтому выпадают уже при полунасыщении сульфатом аммония. Как класс они крупнее и гораздо разнороднее. Одной молекулярной массы «у глобулинов» нет, и выдумывать ее не следует. При нагревании глобулины, как и альбумины, способны свертываться.

Фракции электрофореза сыворотки — α1, α2, β и γ — это группы подвижности, а не четыре индивидуальных простых белка. В гамма-зоне лежат антитела. Среди альфа- и бета-глобулинов есть переносчики металлов, липидов и гормонов и ингибиторы протеаз. Многие из них содержат углевод, липид или ион металла. По высаливанию они попадают в глобулиновую фракцию, а по химии относятся к сложным белкам следующей темы. Фибриноген тоже осаждается вместе с глобулинами, но это гликопротеин. Функцию «всех глобулинов» назвать нельзя: класс собран по растворимости, а не по одной работе.

12Гистоны, протамины, проламины и глютелины

Гистоны

Гистоны — основные ядерные белки. В них много лизина и аргинина, pI лежит в щелочной области, и при физиологическом pH молекула положительна. Этот заряд притягивается к фосфатам ДНК и нейтрализует их. В том и физико-химический смысл упаковки: не «гистон умеет сворачивать ДНК» как заклинание, а электростатическое соответствие поликатиона и полианиона.

Гистоны растворимы в воде и в разбавленных кислотах. Аммиак их осаждает. Плотного свертывания при кипячении, какое дают альбумины, они обычно не образуют. Это свойство класса, а не закон для каждой редкой изоформы.

Основных типов пять. Коровые H2A, H2B, H3 и H4 относительно невелики, учебный ориентир — порядка 10–15 кДа. Они собираются в октамер, вокруг которого удерживается ДНК. Линкерный H1 крупнее, больше 20 кДа, особенно богат лизином и фиксирует ДНК снаружи этой частицы. Числа витков и пар оснований — тема нуклеопротеинов и строения хроматина; здесь достаточно заряда и состава. У бактерий гистонов нет. Они характерны для ядер эукариот.

Хвосты гистонов можно ацетилировать и метилировать. Ацетилирование лизина снимает положительный заряд и ослабляет хватку ДНК. Это снова свойство заряда, а не отдельная лекция по эпигенетике. Сам полипептид гистона — простой белок. Комплекс с ДНК — нуклеопротеин.

Протамины

Протамины еще основнее гистонов. В типичных протаминах рыб преобладает аргинин; точная доля зависит от конкретного белка и в одну процентную константу не сводится. Молекулы небольшие. Классические примеры — сальмин семги, клупеин сельди, стурин осетра; их много в молоках.

В сперматогенезе этих организмов протамины замещают гистоны и упаковывают ДНК плотнее. Хроматин при этом неактивен. Роль структурная. Регуляторной игры гистоновых хвостов у протаминов нет. Они растворимы в воде и разбавленной кислоте, типичного теплового свертывания не дают и хорошо осаждаются алкалоидными реактивами: на широком диапазоне pH они остаются катионами. Протамин без ДНК — простой белок. Протамин с ДНК — нуклеопротеин, как и нуклеогистон.

Проламины

Проламины — запасные белки эндосперма злаков. Они нерастворимы в воде и в солевых растворах, нерастворимы в абсолютном этаноле и растворимы в водном этаноле 60–80%. Это их экзаменационный признак. Название связано с обилием пролина и с аммиаком, который дает при гидролизе амид глутаминовой кислоты. Лизина мало, поэтому как единственный пищевой белок проламины неполноценны.

Имена даны по роду растения: глиадин пшеницы, зеин кукурузы, гордеин ячменя, авенин овса, секалин ржи. Глиадин вместе с глютенином образует клейковину, глютен. Пептиды глютена — антиген целиакии; иммунный механизм этой болезни в данный билет не входит.

Глютелины

Глютелины — тоже запасные белки злаков, но растворитель другой. Они нерастворимы в воде, солях и этаноле. В раствор их переводят разбавленные кислоты и щелочи. Крупные полимеры сшиты дисульфидами, поэтому помогают также детергенты, хаотропы и восстановители: они разбирают агрегат, который в воде не расходится. Примеры — глютенин пшеницы и оризенин риса. У риса основная запасная форма как раз глютелин. Дисульфидные связи глютенина участвуют в упругости теста. Это следствие химии цистина, а не технология хлеба.

Современный разбор последовательностей часто сближает глютелины с проламинами. Экзамен их не сливает: проламин узнают по 60–80% этанолу, глютелин — по кислоте и щелочи при нерастворимости в спирте.

13Протеиноиды: коллаген, эластин, кератин

Протеиноиды, или склеропротеины, — фибриллярные белки механической роли. Они практически нерастворимы в воде, солях, разбавленных кислотах и щелочах. Их не извлекают растворителями альбуминов и глобулинов: после экстракции они остаются в тканевом остатке. Нерастворимость создают вытянутая регулярная структура и ковалентные сшивки, а не простетическая группа. Поэтому на экзамене это простые белки, хотя у части молекул коллагена на гидроксилизине сидит небольшой углевод.

В медицинском курсе обязательны коллаген, эластин и кератин. Фиброин шелка иногда добавляют как пример: у него складчатая структура и много глицина, аланина и серина. Для ответа достаточно одного предложения.

Коллаген

Коллаген — основной белок сухожилий, дермы, органического матрикса кости и хряща. Генетических типов много, химическая подпись общая: повтор глицин–X–Y. Глицин стоит каждым третьим остатком, иначе три цепи не упакуются в тройную спираль. В положениях X и Y часто стоят пролин и 4-гидроксипролин. Жесткие кольца пролина задают изгиб цепи, гидроксипролин стабилизирует тройную спираль водородными связями. Гидроксилизин может нести небольшой углевод.

Гидроксилирование пролина и лизина ведут железосодержащие гидроксилазы, которым нужна аскорбиновая кислота, чтобы удерживать железо в восстановленном состоянии. Без этого спираль стабилизируется плохо, и соединительная ткань слабеет. Так биохимия коллагена связана с цингой. Клинику цинги здесь не разворачивают.

Волокно дополнительно сшито ковалентно и поэтому нерастворимо. Длительное кипячение в воде рвет достаточно нековалентных контактов и часть сшивок. Получается желатин: денатурированный коллаген. Он растворяется в горячей воде и при охлаждении дает студень. Желатин, как и сам коллаген, практически лишен триптофана и пищево неполноценен. Как альбумин при кипячении он не свертывается. Желатин — не отдельный класс нативного белка и не эластин.

Эластин

Эластин есть в связках, эластических артериях и легких. Он дает обратимую тягу. Цепи сшиты десмозином и изодесмозином. Эти сшивки собраны из остатков лизина, в учебном описании — из четырех, и соединяют несколько цепей в сеть. Сеть плюс гидрофобная последовательность объясняют и эластичность, и нерастворимость.

Пролин в эластине есть. Мало по сравнению с коллагеном гидроксипролина и практически нет гидроксилизина. Утверждение «в эластине нет пролина, поэтому там обычные альфа-спирали» неверно. При кипячении эластин в желатин не превращается. Это главный практический отличительный признак от коллагена.

Кератин

Кератин — белок эпидермиса, волос, ногтей, рога. В альфа-кератине много цистина. Дисульфидные связи сшивают цепи. Чем больше сшивок, тем тверже и тем хуже кератин растворяется в тех растворителях, которые легко берут глобулярный белок. Восстановитель рвет дисульфиды и размягчает волокно, повторное окисление может зафиксировать новую форму. Это прямое физико-химическое следствие цистина, а не отдельная бытовая химия.

Общий медицинский смысл этих трех белков в том, что механика ткани есть следствие нерастворимости и сшивок. Соединительная ткань — не белковый раствор. Желатин и размягчение кератина восстановителем — наглядные опыты денатурации и дисульфидной связи, а не отдельные темы.

14На экзамене

15Частая ошибка